## 단일 세포 RNA-seq (scRNA‑seq) 개요 **scRNA‑seq**는 개별 세포의 전사체(transcriptome)를 측정하여, 세포 간 유전자 발현 이질성과 세포 상태 변화를 분석하는 강력한 기술입니다. 주로 세포 유형 동정, 분화 궤적 분석, 세포 간 상호작용 연구 등에 활용됩니다. --- ## 1. 원리 및 핵심 개념 1. **세포 분리(Cell Isolation)** - **Microfluidics**: 10x Genomics Chromium, Fluidigm C1 - **Droplet-based**: Drop‑seq, inDrop - **Plate-based**: Smart‑seq2/3 2. **바코딩 & 라이브러리 제작** - **세포 바코드(Cell barcode)**: 각 세포별 고유 식별자 - **UMI (Unique Molecular Identifier)**: PCR 증폭 편향 보정 - **역전사(Reverse transcription)** → **PCR 증폭** → **어댑터 부착** 3. **시퀀싱** - Illumina paired-end 또는 single-end --- ## 2. 실험 프로토콜 개요 1. **시료 전처리**: 조직/세포 현탁 → 살아 있는 세포 분리 및 세포수 측정 2. **세포 캡처 & 바코딩**: Microfluidic chip 또는 droplet에 세포+비드(바코드) 결합 3. **라이브러리 구성**: 역전사 → cDNA 증폭 (UMI 적용) → 라이브러리 QC (Bioanalyzer 등) 4. **시퀀싱**: Illumina NovaSeq, NextSeq 등으로 50–150 bp 읽기 --- ## 3. 데이터 분석 파이프라인 ### 3.1 전처리 및 QC - **Read Processing**: `Cell Ranger`, `kallisto|bustools`, `STARsolo` - **QC 메트릭**: 총 UMI 수, 발현 유전자 수, 미토콘드리아 유전자 비율 - **저품질 세포 필터링**: UMI < 500, 유전자 수 < 200, mt% > 10% ### 3.2 정규화 & 배치 보정 - **정규화**: CPM/TPM, 로그 변환 (`Seurat::NormalizeData`, `scanpy.pp.normalize_total`) - **배치 효과 제거**: Harmony, Seurat 통합(CCA), BBKNN, MNN ### 3.3 차원 축소 & 클러스터링 - **고변이 유전자 선택**: HVG 선정 (`FindVariableFeatures`, `scanpy.pp.highly_variable_genes`) - **차원 축소**: PCA → UMAP/t‑SNE - **그래프 기반 클러스터링**: Louvain, Leiden ### 3.4 세포 타입 주석(Cell Annotation) - **마커 유전자**: 클러스터별 marker 발굴 (`FindAllMarkers`, `scanpy.tl.rank_genes_groups`) - **자동 주석**: SingleR, scCATCH, CellTypist ### 3.5 하위 분석(Optional) - **차등 발현(DE) 분석**: Wilcoxon, MAST - **분화 궤적 분석**: Monocle3, Slingshot, PAGA - **세포–세포 상호작용**: CellPhoneDB, NicheNet, CellChat - **유전자 세트 분석**: GSEA, GO/KEGG enrichment --- ## 4. 주요 도구 비교 |단계|Seurat|Scanpy|Monocle3| |---|---|---|---| |전처리 & QC|✔︎|✔︎|기본 지원| |정규화|CPM, 로그 변환|total counts, 로그|크기요인 기반| |배치 보정|CCA, Harmony|BBKNN, Harmony|지원 제한적| |클러스터링|Louvain/Leiden|Louvain/Leiden|Leiden/Cluster| |차원 축소|PCA, UMAP, t‑SNE|PCA, UMAP, t‑SNE|UMAP, DDRTree| |분화 궤적|Slingshot 연동|PAGA|Monocle3 기본| |상호작용 분석|CellPhoneDB, NicheNet|CellChat 연동|지원 제한적| --- ## 5. 응용 사례 - **발달 생물학**: 배아 발달 시기별 세포 분화 궤적 분석 - **종양 이질성**: 암 조직 내 종양세포 및 면역세포 클러스터 규명 - **면역학**: 면역세포 활성화 상태 및 사이토카인 네트워크 탐색 - **재생의학**: 줄기세포 분화 및 재생 과정에서의 전사체 동역학 연구 --- ## 6. 참고 문헌 1. Zheng GX et al., _Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells_, Nature Communications, 2017. 2. Stuart T et al., _Comprehensive Integration of Single-Cell Data_, Cell, 2019. 3. Wolf FA et al., _Scanpy: large-scale single-cell gene expression data analysis_, Genome Biology, 2018.