## 단일 세포 ATAC-seq (scATAC‑seq) 개요 **scATAC‑seq**는 단일 세포 수준에서 크로마틴 접근성을 측정하는 실험 기법으로, 세포 간 조절 요소 활성성의 이질성을 분석하는 데 사용됩니다. Tn5 트랜스포제를 이용한 tagmentation 과정을 통해 열려 있는 염색질 영역에만 시퀀싱 어댑터를 삽입한 후, 개별 세포별 바코드를 부착하여 Illumina 시퀀싱을 수행합니다. --- ## 1. 원리 및 핵심 개념 1. **Tn5 hyperactive transposase**: 크로마틴의 열린 영역에 우선 결합하여 DNA를 절단하고 어댑터를 동시에 부착. 2. **Tagmentation**: 핵 상태에서 열린 영역만 태깅(tag) → 어댑터가 달린 프래그먼트 생성. 3. **프래그먼트 크기 분포**: - <100 bp: 뉴클레오좀 비포함 영역 (Nucleosome-Free Region) - 180 bp 단위 피크: 뉴클레오좀 포장 단계 반영 4. **단일 세포 바코딩**: Microfluidics(10x Chromium) 또는 combinatorial indexing을 통해 세포별 고유 바코드를 PCR 어댑터에 부착. --- ## 2. 실험 프로토콜 1. **세포 준비**: 살아 있는 세포를 핵 분획(nuclei isolation) 단계로 분리 2. **Tn5 처리**: 핵에 hyperactive Tn5-transposome 처리 (tagmentation) 3. **PCR 증폭**: 어댑터 결합된 프래그먼트 증폭 및 세포 바코드 도입 4. **라이브러리 QC**: 프래그먼트 길이 분포, 농도 확인 5. **시퀀싱**: Illumina 플랫폼 (paired-end) --- ## 3. 데이터 분석 파이프라인 ### 3.1 전처리 (Preprocessing) - 어댑터 제거: `Trim Galore!`, `cutadapt` - 정렬: `bowtie2`, `BWA` - 중복 제거: `samtools markdup`, `Picard` - QC 메트릭 계산: fragments 수, TSS enrichment (e.g., `ArchR`, `SnapATAC`) ### 3.2 피크 호출 (Peak Calling) - Pseudo‑bulk 방식: 클러스터 또는 전체 세포 합쳐 `MACS2` - 머지(Merging): 클러스터별 피크를 통합하여 공통 피크 세트 생성 ### 3.3 접근성 매트릭스 생성 - 세포 × 피크 희소 행렬 생성 ### 3.4 정규화 및 차원 축소 - TF‑IDF 변환 → LSI (SVD) - UMAP / t‑SNE 임베딩 ### 3.5 클러스터링 및 세포 타입 주석 - k-NN 그래프 → Louvain/Leiden - 클러스터별 접근성 마커 및 통합 분석 (`Seurat/Signac`, `ArchR`) ### 3.6 기능 해석 - 차별 접근성(region) 분석: Wilcoxon 등 통계 테스트 - 모티프 분석: `chromVAR`, `HOMER` - 전사인자 활동성 추정 및 조절 네트워크 구축 --- ## 4. 주요 도구 비교 |단계|ArchR|Signac (Seurat)|SnapATAC| |---|---|---|---| |QC & 필터링|✔︎ (TSS, fragments)|✔︎|✔︎| |피크 호출|MACS2 wrapper|MACS2 호출 직접|MACS2| |정규화 & LSI|✔︎|✔︎|✔︎| |임베딩 (UMAP)|✔︎|✔︎|✔︎| |모티프 분석|chromVAR 연동|chromVAR 연동|chromVAR 인터페이스| |다중 오믹스 통합|Harmony, label transfer|WNN (RNA+ATAC)|Label transfer| --- ## 5. 응용 사례 - **세포 이질성 분석**: 종양 미세환경 내 종양세포/면역세포 크로마틴 상태 차이 탐지 - **발달 생물학**: 세포 분화 과정에서 조절 요소 활성화 변화 추적 - **질병 메커니즘 연구**: 염증, 자가면역 질환 등에서 조절 네트워크 변화 분석 --- ## 6. 참고 문헌 1. Buenrostro JD et al., _Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation_, Nature, 2015. 2. Granja JM et al., _ArchR: an integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis_, Genome Biology, 2021. 3. Stuart T et al., _Comprehensive Integration of Single-Cell Data_, Cell, 2019.