디멀티플렉싱(demultiplexing)은 RNA 시퀀싱(RNA-seq) 분석에서 중요한 과정으로, 특히 단일세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)에서 많이 사용됩니다. ## 디멀티플렉싱이란? 디멀티플렉싱은 하나의 시퀀싱 실험에서 여러 샘플을 동시에 처리한 후, 각 시퀀싱 리드(read)가 어떤 원본 샘플에서 왔는지 구분하는 과정입니다. ## RNA-seq에서의 디멀티플렉싱: 1. **일반적인 RNA-seq**: 여러 샘플을 시퀀싱할 때, 각 샘플에 고유한 바코드(또는 인덱스)를 부착합니다. 시퀀싱 후, 이 바코드를 이용해 각 리드를 원래 샘플로 재분류하는 과정이 디멀티플렉싱입니다. 2. **단일세포 RNA-seq**: 여러 세포 또는 다양한 실험 조건의 세포들을 하나의 시퀀싱 라이브러리에 함께 넣을 때, 세포 바코드(cell barcodes)를 사용하여 각 리드가 어떤 세포에서 왔는지 구분합니다. ## 해시태그 디멀티플렉싱(Cell Hashing): 귀하의 터미널 출력에서 언급된 해시태그 디멀티플렉싱은 특별한 유형으로, 세포 해싱(Cell Hashing) 또는 CITE-seq(Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing)과 관련됩니다. 1. **원리**: 서로 다른 샘플의 세포들에 고유한 항체-올리고 태그(antibody-oligo tags, 해시태그 또는 HTO)를 부착합니다. 2. **목적**: - 여러 샘플의 세포들을 하나의 시퀀싱 실험에서 혼합하여 비용 절감 - 배치 효과(batch effect) 감소 - 더블릿(doublet, 두 개의 세포가 하나의 드롭렛에 들어간 경우) 검출 3. **과정**: - 각 샘플의 세포에 고유한 HTO로 라벨링 - 모든 샘플의 세포들을 혼합하여 시퀀싱 - HTO 시그널에 따라 각 세포를 원래 샘플로 분류 - Negative(HTO 없음), Singlet(단일 HTO), Doublet(여러 HTO) 등으로 분류 귀하의 출력에서는 CMOC1과 CMOC2라는 두 개의 해시태그를 사용했으나, 임계값 설정 문제로 인해 모든 세포가 "Negative"로 분류된 것으로 보입니다. 이 문제를 해결하려면 임계값을 낮추거나 분류 알고리즘을 조정할 필요가 있을 것입니다.